В настоящем обзоре представлены современные данные о происхождении моноцитов/ макрофагов, условиях, необходимых для дифференцировки моноцитов в макрофаги М1 или М2. Описаны три субпопуляции моноцитов периферической крови: 1) классические – основная субпопуляция (85-90%), эффективно осуществляющая фагоцитоз; 2) промежуточные моноциты (5-10%) – участвуют в процессинге и презентации антигена, в ангиогенезе, восстановлении эндотелия сосудов; 3) неклассические моноциты (10%) – «патрулируют» сосудистую сеть, удаляют клеточный дебрис, участвуют в ремоделировании тканей. В обзоре приведены подробные характеристики для каждого подкласса макрофагов: провоспалительные (М1) и противовоспалительные (М2), играющие разные роли в инициации и разрешении воспаления; описаны их фенотип, спектр секретируемых цитокинов, экспрессия транскрипционных факторов, выполняемые функции. Для популяции М2 подробно описаны особенности субпопляции: М2a, М2b, М2c, М2d. В обзоре приведены методы и подходы к получению поляризованных макрофагов в условиях in vitro как из моноцитов периферической крови, так и из клеток перевиваемых культур, основанные на сигналах, получаемых макрофагами в условиях in vivo; приведены фенотип, продукция цитокинов и функциональные свойства искусственно поляризованных макрофагов в зависимости от условий их получения. В обзоре подробно рассматриваются особенности контактного и дистантного взаимодействия макрофагов различных подклассов с клетками микроокружения на примере естественных киллеров и клеток трофобласта, приводятся сведения об изменении фенотипа, транскрипционного и секреторного профиля взаимодействующих клеток. Описаны механизмы контроля трофобластом дифференцировки макрофагов в уникальную М2-популяцию децидуальных макрофагов, контролирующих как развитие и функционирование трофобласта, так и его апоптоз. В обзоре подробно рассматриваются известные на сегодняшний день варианты взаимодействия субпопуляций макрофагов с естественными киллерами. Влияние Мϕ на NK-клетки проявляется в изменении экспрессии последними транскрипционных факторов, определяющих не только их дифференцировку, но и функциональную активность. Макрофаги рассматриваются как клетки, активно влияющие на функциональное состояние и дифференцировку естественных киллеров. В обзоре рассматриваются механизмы взаимоотношений всех трех типов клеток: макрофагов, трофобласта и естественных киллеров в зоне маточно-плацентарного контакта. Изучение взаимодействий этих клеток прольет свет не только на особенности межклеточных взаимоотношений в зоне маточно-плацентарного контакта, но и на взаимоотношения клеток опухолей с NK-клетками и макрофагами.

Помимо хорошо известных субпопуляций Т-лимфоциов адаптивного иммунитета и лимфоцитов врожденного иммунитета (innate lymphoid cells) существует промежуточная группа лимфоцитов (innate-like cells), уже обладающая Т-клеточным рецептором, но с ограниченным репертуаром. В эту группу следует отнести γδТ-клетки, субпопуляции NKT-клеток I и II типов, несущих как Т-рецептор, так и рецепторы NK-клеток и mucosal-associated invariant T (MAIT) клетки. Развитие innate-like cells происходит в тимусе, однако положительная и отрицательная селекция их проходит без участия эпителиальных клеток тимуса. Отличительной особенностью является то, что innate-like cells приобретают эффекторный фенотип уже в тимусе, поэтому не требуют сложных реакций активации при распознании антигена. На момент выхода из тимуса неканонические Т-клетки экспрессируют хемокиновые рецепторы, позволяющие им мигрировать в барьерные ткани уже в раннем возрасте. Характерной особенностью Т-клеточного рецептора innate-like cells является распознавание непептидных антигенов, презентированных в неполиморфных молекулах тканевой совместимости (МНС-Ib). К этому типу молекул относятся молекулы CD1 a/b/c/d/e и молекула MR1. Эти молекуклы презентируют липидные, гликолипидные антигены и метаболиты витаминов группы В, синтезируемые различными представителями микробиоты. Наличие функционально различных субпопуляций innate-like cells, имеющих активированный фенотип, позволяют им быстро реагировать на антиген продукцией цитокинов, типичных для Th1, Th2, Th17. Также они обладают цитотоксической и иммунорегуляторной активностью. Эти клетки активно вовлечены в регуляцию гомеостаза барьерных тканей и взаимодействие с микробиотой. Они синтезируют факторы роста для эпителиальных клеток, фибробластов, эндотелия сосудов, что необходимо для регенерации поврежденных тканей. Также они участвуют в противоинфекционной защите, направляя развитие иммунного ответа. Более того, они оказались участниками многих аутоиммунных заболеваний. Особенности функционирования innate-like cells делают их перспективной мишенью для терапевтических воздействий. Показано, что антибиотики, салицилаты и некоторые другие известные препараты оказывают влияние на innate-like cells. Различные варианты диеты также влияют на активность этих клеток.

Доминирующими этиологическими факторами стерильного воспаления при иммуновоспалительных ревматических заболеваниях являются провоспалительные вне- и внутриклеточные DAMPs, генерирующиеся при системной прогрессирующей дезорганизации рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани, регулируемой гибели клеток и некрозе клеток. Стерильное воспаление является многоступенчатым процессом, при котором индуцируется последовательность реакций, опосредованных лейкоцитами и резидентными клетками макрофагально-моноцитарного ряда, направленных на очищение очага воспаления от клеточного и тканевого детрита, с последующим восстановлением гомеостаза поврежденной ткани. Важная роль в этом процессе принадлежит трансэндотелиальной миграции лейкоцитов в очаг стерильного воспаления и формирование клеточного воспалительного инфильтрата. Ключевой особенностью указанных процессов является реактивность PRR-рецепторов и, как следствие PRR-DAMPs взаимодействий, последующий запуск молекулярноклеточных процессов, итогом которых является картина локальных и/или системных проявлений стерильного воспаления. Следствием PRR-DAMPs взаимодействий является активация врожденного иммунитета и запуск молекулярно-клеточных реакций, позволяющих отнести иммуновоспалительные ревматические заболевания к категории системных стерильных аутовоспалительных процессов. Генерализованность патофизиологических эффектов провоспалительных DAMPs и, соответственно, системность и полиорганность поражения тканей и внутренних органов при иммуновоспалительных ревматических заболеваниях обусловлено широкой распространенностью рецепторов к «сигналам опасности». В развитии DAMP-опосредованного стерильного воспаления важнейшее место занимает феномен кросс-презентации и аутофагия. Кросс-презентация обуславливает презентацию внеклеточных DAMPs из интернализованных белков с молекулами МНС класса I аутореактивным CD8⁺ цитотоксическим Т-лимфоцитам. Аутофагия обеспечивает процессинг внутриклеточных пептидных DAMPs, их загрузку на молекулы МНС класса II с последующей индукцией CD4⁺Т-клеточного адаптивного иммунного ответа. Важный вклад в указанные процессы вносят врожденные лимфоидные клетки. Модель функциональной сопряженности и взаимодополняемости ILCs и Th-CD4⁺Т-клеток расширило наши представления об иммунной регуляции, распространив активность врожденного и адаптивного иммунитета в область поддержания тканевого гомеостаза, морфогенеза, репарации, регенерации и воспаления. Следствием PRR-DAMP взаимодействий тканевых ILCs и последующего подключения клеточных пар ILC – Th-CD4⁺Т-клеток является прогрессирование системного стерильного воспаления. Представленные в настоящем обзоре материалы определяют перспективные молекулярные и клеточные мишени с целью регуляции и/или ингибирования активности стерильного воспаления при иммуновоспалительных ревматических заболеваниях.

Метаболизм аргинина играет важную роль в регуляции функций клеток иммунной системы у млекопитающих. Патогенные микробы используют механизм истощения аргинина для подавления иммунного ответа при инфекции. Аргининдеиминаза – микробный аргинин-гидролизующий фермент, необходимый для выживания при низком рН в очаге инфекции или внутри фаголизосом, а также в условиях низкого содержания глюкозы. Влияние бактериальной аргининдеиминазы на функции клеток адаптивного иммунного ответа остается слабо изученным. Цель исследования состояла в изучении влияния стрептококковой аргининдеиминазы на пролиферацию и аутофагию CD4⁺ и CD8⁺ популяций Т-лимфоцитов периферической крови человека.

Действие фермента на клетки изучали с использованием супернатантов разрушенных ультразвуком Streptococcus pyogenes M49-16 и его изогенного мутанта с инактивированным геном arcA (Streptococcus pyogenes M49-16delarcA). Исследование проводили с использованием крови здоровых доноров. Фракцию мононуклеарных лейкоцитов выделяли путем центрифугирования на градиенте плотности Фиколла. Для оценки пролиферации использовали метод, основанный на окрашивании внутриклеточных белков прижизненным флуоресцентным красителем carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). Исследование уровня аутофагии в клетках проводили с использованием флуоресцентного красителя Lysotracker Green DND-26. Для анализа пролиферации и аутофагии Т-хелперов (CD3⁺CD4⁺) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3⁺CD4^-) клеточные суспензии, окрашивали антителами против CD4, CD45RA, и CD3. Долю клеток в состоянии некроза определяли путем их окрашивания флуоресцентным ДНК-связывающим красителем DAPI. Нормальность распределения оценивали тестом Шапиро–Уилка. Данные были проанализированы с использованием критерия Краскела–Уоллиса с последующим применением критерия Манна–Уитни для попарных сравнений и выражены в виде медианы и межквартильных диапазонов (Q_0,25-Q_0,75).

Сравнение эффектов супернатантов разрушенных стрептококков исходного и мутантного штаммов, которые отличались по экспрессии одного гена аргининдеиминазы, показало, что бактериальный фермент не оказывал влияния на функции неактивированных лимфоцитов. Однако стрептококковая аргининдеиминаза полностью подавляла стимулированную anti-CD2/CD3/CD28 антителами пролиферацию CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитов. Эти эффекты сопровождались снижением в клетках уровня аутофагии. В то же время аргининдеиминаза не обладала цитотоксическими эффектами в отношении лимфоцитов. Введение супрафизиологических концентраций L-аргинина исследуемые восстанавливало клеточные функции. Различий между исследуемыми параметрами CD4⁺ и CD8⁺ популяций Т-лимфоцитов выявлено не было.

Полученные данные показывают, что антипролиферативное действие аргининдеиминазы может быть связано со способностью фермента ингибировать аутофагию и доказывают способность бактериального фермента подавлять адаптивные иммунные реакции организма-хозяина.

В последнее десятилетие в связи с широким распространением многоцветной проточной цитометрии для рутинных тестов в зарубежной литературе появились единичные сообщения о выявлении в крови и костном мозге пациентов минорной субпопуляции NK-клеток со слабой коэкспрессией В-клеточного антигена CD19. Практически отсутствует оценка частоты встречаемости и относительного количества CD56⁺CD19^+dim клеток, нет данных о фенотипических особенностях, а также связи этой субпопуляции с какой-либо патологией. Цель исследования – оценить частоту встречаемости, относительное количество и фенотипические характеристики минорной субпопуляции лимфоцитов CD56⁺CD19^+dim в образцах крови пациентов, направляемых на исследование субпопуляционного состава лимфоцитов. Материалом являлась периферическая кровь иммунокомпрометированных лиц. Методом восьмицветной проточной цитометрии определяли субпопуляционный состав лимфоцитов с использованием маркеров CD3, CD4, CD8, CD19, CD25, CD45, CD56, HLA-DR. Для оценки частоты встречаемости субпопуляции CD56⁺CD19^+dim осуществляли ретроспективный анализ LMD-файлов 1210 исследований для 935 пациентов. Средний возраст обследованных лиц 39,8±14,7 года, среди них 84 ребенка до 18 лет. Ряду пациентов исследование выполнялось неоднократно. Дополнительное фенотипирование CD56⁺CD19^+dim клеток проводили с использованием широкой панели антител к В-клеточным и T/NK-клеточным антигенам. Частота встречаемости образцов крови, содержащих CD56⁺CD19^+dim клетки, составила 1,2%, при относительном количестве субпопуляции 2,1±1,9% от лимфоцитов и 0,8±0,6% от лейкоцитов. Максимальный размер субпопуляции составил 8,8% от лимфоцитов (2,8% от лейкоцитов). Отмечено длительное сохранение субпопуляции на протяжении всего периода наблюдения за пациентами – от двух месяцев до 6 лет. Сопоставление экспрессии дополнительных маркеров субпопуляциями NK-лимфоцитов CD56⁺CD19^+dim и CD56⁺CD19^- выявило особенности первой, а именно высокую экспрессию CD2 и CD57, сниженную плотность экспрессии CD7, CD16, CD38. Определен фенотип изученной субпопуляции: CD56^+dimCD19^+dimCD2^+brightCD7^+dimCD11c⁺CD16^+dimCD38^+dimCD45RA⁺CD57⁺CD94^+dimNKG2D⁺CD3^-CD4^-CD5^-CD20^-CD21^-CD25^-CD45R0^-CD62L^-CD79b^-CD117^- с вариабельной экспрессией CD8 и HLA-DR. Фенотип соответствует активированным терминально дифференцированным адаптивным NK-лимфоцитам, связанным с цитомегаловирусной инфекцией. В нашей работе у лиц с субпопуляцией CD56⁺CD19^+dim лимфоцитов в крови отмечена цитомегаловирусная инфекция в анамнезе и реактивация хронической ВЭБ-инфекции на момент исследования. Вероятной причиной коэкспрессии CD19 может быть трогоцитоз NK-клеткой фрагмента мембраны В-лимфоцита при активной ВЭБ-инфекции. Cубпопуляция CD56⁺CD19^+dim лимфоцитов может достигать заметных величин и искажать результаты иммунологических исследований, выполняемых методом проточной цитометрии. Особенно вероятны ошибки при оценке минимальной определяемой болезни при острых В-клеточных лейкозах. Минорная популяция NK-лимфоцитов CD56⁺CD19^+dim может быть идентифицирована в рутинных иммунологических исследованиях, а ее функциональные особенности и связь с патологией нуждаются в дальнейшем изучении.

Атопическая бронхиальная астма – это хроническое заболевание, характеризуемое обструкцией дыхательных путей, бронхиальной гиперреактивностью и воспалением. У пациентов наблюдается повышенная активация иммунных клеток в дыхательных путях, в особенности Т-лимфоцитов, что приводит к хроническому воспалению. Известно, что лимфоциты больных астмой имеют нарушенный ответ на программируемую клеточную гибель 1-го и 2-го типа – апоптоз и аутофагию, что способствует пролонгации и усилению воспалительного процесса. В сравнении с апоптозом, аутофагия также может способствовать выживанию клетки в условиях стресса, а ее нарушение и гиперактивация – приводить к отягощению аллергических реакций. Основными препаратами для лечения атопической бронхиальной астмы являются глюкокортикоиды, которые активируют глюкокортикоидный рецептор, запускающий в клетке противовоспалительный ответ и, в частности, апоптоз. Однако у некоторых пациентов наблюдается устойчивость к терапии из-за различных факторов, включающих однонуклеотидные полиморфизмы гена глюкокортикоидного рецептора NR3C1. Наибольшая связь тяжести астмы с устойчивостью к терапии была выявлена у GG-варианта полиморфизма Bcl1. Общие молекулярные пути активации глюкокортикоидного рецептора и программируемой клеточной гибели и опосредующие молекулярные компоненты позволяют предположить значимость роли полиморфного рецептора в уходе клеток от гибели. Целью нашего исследования являлась оценка влияния G-аллели в однонуклеотидном полиморфизме Bcl1 гена NR3C1 глюкокортикоидного рецептора на экспрессию генов-регуляторов апоптоза (BCL2, CASP3) и аутофагии (BECN1, LC3) в лимфоцитах больных средней и тяжелой формой атопической бронхиальной астмы. Материалом исследования служили образцы периферической крови 24 пациентов в возрасте от 20 до 45 лет с установленным диагнозом «атопическая бронхиальная астма» средней и тяжелой степени. Методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов пациенты были распределены по генотипам полиморфизма Bcl1 гена NR3C1: 12 человек – CC-генотип, 8 человек – GC, 4 человека – GG-генотип. Лимфоцитарную фракцию выделяли на градиенте плотности фиколла и культивировали с дексаметазоном в условиях истощения питательных веществ. Уровень экспрессии генов определяли методом ПЦР в реальном времени. При исследовании влияния различных генотипов BclI полиморфизма на экспрессию генов-маркеров клеточной гибели, в лимфоцитах пациентов с GG-полиморфизмом под воздействием дексаметазона были выявлены антиапоптотические реакции, что может являться одним из механизмов развития резистентности к терапии глюкокортикостероидами при астме. Нарушение активации экспрессии гена BECN1 у больных с GG-генотипом может предполагать дерегуляцию процесса аутофагии у этой группы пациентов, как способа программируемой клеточной гибели. Несмотря на это, у больных с GC-генотипом при длительном культивировании воздействие дексаметазона повышает экспрессию гена LC3, указывающую на более выраженную активацию аутофагии. Таким образом, данная работа демонстрирует различия в ответе лимфоцитов на терапию синтетическими глюкокортикоидами, а также раскрывает влияние G-аллели в генотипе Bcl1 полиморфизма на нарушение регуляции программируемой клеточной гибели под воздействием дексаметазона.

На сегодняшний день рецидивы полипозного риносинусита (ПРС) остаются неразрешенной проблемой. Поэтому необходима идентификация пациентов с неконтролируемым течением ПРС.

Цель работы – изучить цитокиновый профиль носовых полипов и клинические характеристики у пациентов с разной степенью медикаментозного контроля полипозного риносинусита. У 99 пациентов с ПРС выполнена эндоскопическая полипотомия полости носа. В ткани полипа методом мультиплексного анализа исследовался уровень белков интерферона IFNγ, интерлейкина IL-1β, IL-4, IL-5, IL-13, фактора некроза опухоли TNFα, и трансформирующих факторов роста TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3. Пациенты проходили лечение, согласно алгоритму ступенчатой терапии ПРС [9], через 5 лет наблюдения на основании степени медикаментозного контроля ПРС были распределены группы. 1-я группа – больные с легким течением ПРС, получали лечение по I и II ступени алгоритма за весь период наблюдения. 2-я группа – ПРС средней степени тяжести, терапия ПРС соответствовала II или III ступени алгоритма. 3-я группа – пациенты с тяжелым течением ПРС, с одним или несколько курсов лечения по IV ступени алгоритма. Повторно проведено анкетирование по опроснику SNOT-22, эндоскопический осмотр, оценка клинических симптомов. При наличии бронхиальной астмы (БА) ее контроль оценивали по опроснику ACQ-7. Проведен анализ первоначального цитокинового профиля в носовых полипах этих пациентов по группам.

Результаты:

1. Через 5 лет в 1-й группе с легким течением ПРС наблюдалась минимальная выраженность заложенности носа, нарушения обоняния, наименьшее снижение уровня качества жизни (SNOT-22). Продолжительность БА была меньше, чем в 3-й группе, отмечался хороший уровень ее медикаментозного контроля. В цитокиновом профиле полипов была высокая концентрация IL-4, средние значения IL-1β, TNFα, IFNγ и минимальные значения TGF-β1.

1. Во 2-й группе при ПРС средней степени тяжести были более выраженные нарушения обоняния, заложенность носа и ухудшение качества жизни. Уровень медикаментозного контроля БА был ниже, чем в 1-й группе. Выявлена максимальная концентрация белков IFNγ, IL-1β, TNFα, IL-5, TGF-β1 и TGF-β2.
2. В 3-й группе с плохим медикаментозным контролем ПРС получены максимальные баллы SNOT-22, затруднения носового дыхания, снижение обоняния. Длительность БА выше, а уровень ее медикаментозного контроля ниже по сравнению с 1-й группой. В ткани полипов выявлен минимальный уровень IFNγ, IL-1β, TNFα, IL-4 и IL-5, TGF-β2 и TGF-β3.
3. Лечение пациентов в зависимости от клинических фенотипов ПРС по наличию или отсутствию респираторной аллергии или БА позволяет улучшить медикаментозный контроль и снизить рецидив ПРС.

Резюме. Патофизиология тяжелой формы COVID-19 характеризуется изменением количества, фенотипа и функций нейтрофильных гранулоцитов (НГ). Среди эффекторных противовирусных механизмов НГ одними из наиболее важных являются нейтрофильные внеклеточные ловушки (NETs), но чрезмерное их образование усугубляет воспаление при остром респираторном дистресс-синдроме и способствует тромбозу микрососудов. Их обнаружение и количественная оценка могут иметь важное значение при различных формах течения COVID-19 для определения корреляции с исходом заболевания, оценки риска развития постковидного синдрома и, возможно, мониторинга будущей целевой терапии.

Цель исследования – разработать новый диагностический интеграционный критерий, позволяющий оценить тяжесть течения COVID-19 и риск развития осложнений в постковидном периоде, в том числе постковидного синдрома в периферической крови. Исследованы образцы периферической крови (ПК) 31 пациента с острым течением COVID-19 (среднетяжелого течения (n = 15) и тяжелого течения (n = 16)), 52 пациентов, выписанных из стационара после лечения COVID-19 тяжелой степени тяжести, в сроки от 30 до 60 дней, имеющие постковидный синдром (ПКС) и 100 условно здоровых добровольцев. Оценивались показатели общеклинического анализа крови (MicroCC-20Plus), в мазках ПК проводился подсчет лейкоцитарной формулы с учетом количества образованных NET и НГ, ушедших в патологический апоптоз. На основе полученных результатов рассчитывался интеграционный диагностический критерий по формуле:

$$ ИДК = \frac{\%\ неизменных\ НГ}{\%NET + \%НГ\ в\ апоптозе} $$

Показано снижение ИДК при среднетяжелом течении заболевания в 8,5 раза (p < 0,05), а при тяжелом течении – в 30 раз (p < 0,05), по сравнению со значениями в группе условно здоровых лиц. Также установлено, что у 88,5% пациентов с ПКС, перенесших SARS-CoV-2, в ПК не выявлено морфологически патологических измененных НГ. В то же время у 11,5% пациентов с ПКС отмечено появление NETs и клеток с патологическим апоптозом, при этом ИДК НГ-ПКС был в 8 раз меньше (p < 0,05), чем в группе сравнения и не отличался от показателей пациентов со среднетяжелым течением COVID-19 (p > 0,05), что диктует необходимость дальнейшего диспансерного наблюдения таких пациентов.

Полученные в настоящем исследовании данные свидетельствуют о том, что разработанный интеграционный диагностический критерий позволяет оценить как тяжесть течения COVID-19 в острый период, так и риск возникновения постковидного синдрома. Следует подчеркнуть, что выявленные при COVID-19 характерные изменения НГ можно легко идентифицировать в ПК и последовательно отслеживать по расчетному интегральному диагностическому критерию. Значительное снижение ИДК свидетельствует о сохраняющейся гиперактивации НГ и необходимости проведения таргетной иммунотерапии, направленной на модулирование дисфункций НГ.

При респираторных вирусных инфекциях, наряду с механизмами врожденного иммунитета, важную роль в защите организма играет адаптивная иммунная система. Эффективность ее клеточного звена имеет решающее значение для элиминации патогена. Т-клеточный ответ выявляется практически во всех случаях COVID-19 и является одним из ключевых факторов контроля SARS-CoV-2 в организме и устойчивости к инфекции, в том числе и повторной. Однако к настоящему моменту остаются неясными многие аспекты клеточного иммунного ответа к вирусу SARS-CoV-2 спустя год и более после перенесенной инфекции. Цель – изучить динамику лабораторных показателей постинфекционного клеточного иммунитета к SARS-CoV-2 в течение 16 месяцев от момента появления симптомов.

В исследование было включено 15 здоровых добровольцев и 87 пациентов, перенесших COVID-19. Переболевшие участники были разделены на 3 исследуемые группы в зависимости от времени, прошедшего с момента появления первых симптомов до момента взятия образцов крови для исследования (от 14 до 500 суток). Для всех образцов было выполнено определение количества S- и N-специфичных Т-лимфоцитов и профиль секретируемых цитокинов. Для обнаружения различных функциональных групп клеток был использован алгоритм автоматической кластеризации Phenograph.

Приблизительно 1 из 5 × 10³ мононуклеарных клеток периферической крови была специфична к S-белку SARS-CoV-2, и 1 из 10⁴ к N-белку. С первых недель инфекции количество специфичных CD8⁺ клеток у переболевших было достоверно выше, чем в группе не болевших участников. С увеличением постинфекционного периода количество специфичных CD4⁺ и CD8⁺ клеток постепенно снижается, но остается достоверно выше, чем в контрольной группе. Среди CD4⁺ клеток уменьшается доля IFNγ^-IL-2^-TNFα⁺ клеток и увеличивается доля IFNγ⁺IL-2^-TNFα^-. CD8⁺ лимфоциты в первые недели после начала заболевания представлены преимущественно IFNγ⁺IL-2^-TNFα^- клетками, а к концу наблюдаемого периода – IFNγ^-IL-2^-TNFα⁺. По результатам кластеризации было показано, что на ранних постинфекционных сроках вирус-специфичные Т-лимфоциты представлены популяциями IFNγ- и TNFα-продуцирующих CD4⁺ эффекторных клеток памяти, тогда как на поздних сроках значительную долю составляют TNFα-продуцирующие CD8⁺ TEMRA и IFNγ-продуцирующие CD8⁺Т-лимфоциты центральной памяти.

Т-клеточное звено адаптивного иммунитета играет важную роль в контроле и элиминации вирусных инфекций. В данной работе были продемонстрированы результаты, показывающие, что устойчивый клеточный иммунитет против SARS-CoV-2 присутствует у подавляющего большинства переболевших, начиная с первых недель и вплоть до 16 месяцев с момента появления первых симптомов COVID-19. Иммунная память к SARS-CoV-2 обеспечивается формированием Т-клеток центральной и эффекторной памяти, а полученные данные об их динамике за исследуемый период позволяют надеяться и на более продолжительную клеточную иммунную память к вирусу SARS-CoV-2.

Цель данного исследования – оценка эффективности конкурентного иммуноферментного метода, определяющего антитела, специфически связывающие рецептор-связывающий домен субъединицы S1 шиповидного белка коронавируса SARS-CoV-2 и блокирующие образование инициаторного инфицирующего комплекса между RBD и ангиотензин-превращающим ферментом 2 (псевдонейтрализующий тест, ПНТ) на стадии доклинических исследований вакцины против SARS-CoV-2. Исследовали 37 сывороток крови животных (8 коров, 10 собак, 19 трансгенных мышей линии B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/HEMI Hemizygous for Tg(K18-ACE2)2Prlmn, самки и самцы (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, США)), иммунизированных кандидатными вакцинными препаратами против COVID-19, содержащими белок Spike SARS-CoV-2. В данном исследовании использовали 3 метода определения антител к вирусу SARS-CoV-2, а именно: 1) псевдонейтрализующий тест (ПНТ) для выявление антител, блокирующих взаимодействие RBD и АСE-2; 2) реакцию нейтрализации (РН) для выявления вируснейтрализующих антител и 3) твердофазный иммуноферментный анализ для определения антител класса G к RBD SARS-CoV-2. Результаты выражались, соответственно, в виде коэффициента подавления (КП), титра вируснейтрализующих антител (ВНА) и индекса позитивности (ИП). Полученные данные показывают выраженную, статистически значимую корреляцию между результатами, полученными иммуноферментными методами с титрами ВНА, определенными в вирусологической РН в исследуемых группах животных. Так, коэффициент Спирмена, определенный для корреляции между титрами ВНА и КП, составил, соответственно, 0,9151; 0,8085 и 0,9207 для собак, трансгенных мышей и коров. Коэффициент Спирмена для титров ВНА и ИП составил 0,8854 и 0,8955 для собак и трансгенных мышей. Таким образом, для целей оценки иммуногенности вакцинных препаратов в настоящем исследовании, адекватными и безопасными аналогами РН являются оба метода – ИФА для определения IgG к RBD и ПНТ для определения антител, блокирующих образование комплекса между RBD и ACE-2. Однако преимуществом ПНТ является его универсальность, исключающая необходимость использования различных конъюгатов для выявления антител в сыворотках крови разных видов животных. Данные, полученные нами для образцов трех видов животных (трансгенных мышей, собак и коров), хорошо соотносятся с аналогичными, полученными нами и другими исследователями для сывороток крови людей и демонстрирующими высокую корреляцию между результатами ПНТ-подобных конкурентных тестов для определения антител, блокирующих образование комплекса RBD и ACE-2, с результатами определения ВНА в вирусологической РН. Следовательно, предлагаемый в настоящей работе ПНТ может найти применение при проведении доклинических и клинических испытаний кандидатных вакцинных и лекарственных препаратов.

Большой вклад в патогенез внебольничной пневмонии (ВП) вносят снижение неспецифической резистентности организма, дисбаланс локального и системного иммунитета, нарушение процессов свободно-радикального окисления.

Цель – изучить эффективность включения иммуномодуляторов в комплексное лечение нетяжелой внебольничной пневмонии и оценить отдаленные эффекты проведенной терапии.

В исследование включены пациенты (n = 55) с нетяжелой формой ВП (41 (31-48) года, CRB-65 0,15 (0-1) балла). 1-я группа (контроль) получала только стандартную терапию ВП; в двух других группах одновременно со стандартной терапией назначали иммуномодуляторы: во 2-й группе – бактериальный лизат (БЛ), в 3-й группе – азоксимера бромид (АБ). Концентрация TNFα и IL-6 определялась в день обращения, на 13-й и 60-й дни наблюдения. В течение двух лет у этих же пациентов с перенесенной ВП (n = 55) изучалась частота инфекций нижних дыхательных путей (ИНДП). У всех пациентов (n = 55) отмечались клинические проявления нетяжелой внебольничной пневмонии. Общая продолжительность всех симптомов была ниже в группах иммуномодуляторов, по сравнению с группой контроля: 12 (11-13) дней в группе БЛ (p < 0,001) и 12 (11-12) дней в группе АБ (p < 0,001), между собой группы вмешательства статистически значимо не различались (p = 0,36). Концентрация TNFα, IL-6 на фоне терапии на 13-й и 60-й день снизилась у всех больных; у пациентов, получавших иммуномодуляторы, TNFα, IL-6 достоверно были ниже по сравнению с контролем. Динамика концентрации TNFα и IL-6 в группах на 60-й день исследования по сравнению с исходным уровнем показала снижение в группе БЛ на 85 (-89 – -82) % и 86 (-90 – -85) % (p < 0,001; p = 0,001); в группе АБ – на 82 (-86 – -80) % и 86 (-88 – -84) % (p = 0,002; p = 0,007). Интенсивность снижения концентрации IL-6 на 60-й день в группах БЛ и АБ не различалась (p = 0,72). Скорректированное на пол и возраст отношение шансов развития заболевания нижних дыхательных путей (в течение 2 лет после перенесенной ВП) в группе АБ составило 0,15 (0,02-0,93) (p = 0,04), что свидетельствует о его протективном эффекте.

Включение иммуномодуляторов в базисное лечение нетяжелой внебольничной пневмонии приводит к сокращению длительности симптомов, сопровождается улучшением профиля провоспалительных цитокинов. Отдаленные эффекты проведенной иммуномодулирующей терапии за 2 года наблюдения показали статистически значимо меньшую частоту инфекций нижних дыхательных путей в группе пациентов, получивших АБ.

Диагностика специфического Т-клеточного иммунитета к антигенным детерминантам SARS-CoV-2 у пациентов представляется все более важной задачей ввиду накопления данных о роли Т-клеточного иммунного ответа в протекании коронавирусной инфекции и клиренсе SARS-CoV-2 в случае вторичной инфекции. Ранее нами был разработан рекомбинантный антиген CorD_PS для оценки Т-клеточного противовирусного иммунитета, содержащий консервативные и иммуногенные последовательности структурных белков коронавируса SARS-CoV-2. Был получен его штаммпродуцент E. coli CorD_PS со стабильной экспрессией рекомбинантного антигена CorD_PS. Целью настоящей работы является разработка лабораторной технологии получения рекомбинантного антигена CorD_PS, проведение контроля качества полученного химерного белка и изучение его иммунологической активности. Отработку условий культивирования клеток E. coli CorD_PS проводили в конических колбах в среде LB-M_Km при 37 °C, затем масштабировали в ферментере объемом 30 л. Экспрессию индуцировали добавлением ИПТГ. Контроль экспрессии осуществляли в лизатах культур в 12% ПААГ в денатурирующих условиях. Полученную биомассу лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора с последующим центрифугированием. Были подобраны составы лизирующего и солюбилизирующего буферов, а также условия рефолдинга рекомбинантного белка. Для очистки растворенного белка использовали последовательно катионобменную (SP-сефароза), гидрофобную (Butyl-сефароза) и эксклюзионную (Sephacryl S-200 HR) хроматографии. Белковые примеси в препарате определяли методами обращенно-фазовой ВЭЖХ и электрофореза в 12% ПААГ, остаточные липополисахариды определяли с помощью гель-тромб варианта ЛАЛ-теста, остаточные белки штамма-продуцента – методом иммуноферментного анализа, остаточную ДНК штамма-продуцента – методом связывания с красителем PicoGreen. Контроль специфичности осуществляли методом непрямого иммуноферментного анализа. Оценку продукции цитокинов CD4⁺Т-лимфоцитами в ответ на их стимуляцию рекомбинантным антигеном ex vivo проводили на проточном цитофлуориметре. Выход биомассы при культивировании E. coli CorD_PS в 30 л ферментере составил до 20 г/л за 4 часа индукции 0,1 мМ ИПТГ. Последовательная отмывка телец включения от бактериальных клеточных компонентов и их последующая солюбилизация в буфере, содержащем 8 М мочевину, позволил получить раствор денатурированного антигена с концентрацией 10 мг/мл. Эффективность рефолдинга разведением составила 75%. После трех этапов хроматографической очистки были получены образцы белка с концентрацией 1,2-1,4 мг/мл, чистотой по ВЭЖХ 98,43%, соответствующие ключевым параметрам качества согласно ОФС.1.7.1.0007.15. Рекомбинантный антиген показал специфическое связывание с образцом Первого международного стандарта ВОЗ и образца СОП № 3 анти-SARS-CoV-2 иммуноглобулинов человека в установленном диапазоне концентраций. CD4⁺Т-лимфоциты эффективно отвечали на обработку рекомбинантным антигеном увеличением продукции IFNγ. Оптимальная концентрация рекомбинантного коронавирусного антигена составила 5 мкг/мл. Разработанный технологический процесс позволяет получать 5-7 грамм антигена коронавирусного рекомбинантного CorD_PS за один цикл культивирования в 30 л ферментационной среды с ключевыми параметрами качества согласно ОФС.1.7.1.0007.15. В результате исследований специфической иммунологической активности рекомбинантного коронавирусного антигена CorD_PS была подтверждена концепция возможности его использования в качестве диагностикума для определения формирования Т-клеточного иммунного ответа.

Гиперчувствительный пневмонит (ГП) представляет собой сложный интерстициальный синдром легких. Данная нозология характеризуется сенсибилизацией к специфическому антигену, ранняя идентификация которого связана с повышением вероятности благоприятного исхода. Рост уровня смертности при гиперчувствительном пневмоните связан с развитием фиброза легочной ткани. В то же время из-за недостаточной степени изученности механизмов, лежащих в основе развития данного типа фиброза, клинические вмешательства не позволяют добиться значительного улучшения прогноза течения заболевания. Применение надежных биомаркеров, объективно отражающих биологические процессы, происходящие в процессе фиброзирования легочной ткани, способно повысить вероятность принятия верных клинических решений. В настоящее время разнообразные биомаркеры стали играть решающую роль в диагностике и лечении широкого спектра заболеваний человека. К сожалению, гиперчувствительный пневмонит является исключением из этой общей тенденции. В данной области все еще есть большие возможности для исследований на пути поиска диагностических биомаркеров. Целью настоящего исследования стал поиск биомаркеров развития фиброза легочной ткани у пациентов с гиперчувствительным пневмонитом. В качестве таких диагностических маркеров мы использовали зрелые сывороточные микроРНК, потенциально способные регулировать процессы воспаления и фиброзообразования. В исследование были включены пациенты с диагнозом гиперчувствительный пневмонит (с фиброзом и без фиброза в ткани легкого), а также здоровые лица без хронических заболеваний (группа контроля). У всех пробандов, вошедших в исследование, было получено письменное информированное согласие до момента включения в исследование. У всех пациентов проводилась оценка клинических и лабораторных показателей. Анализ профиля экспрессии генов зрелых сывороточных микроРНК проводили с использованием набора miScript miRNA PCR Array (QIAGEN). Верификацию полученных данных проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. В результате проведенного нами исследования был определен набор зрелых микроРНК, вероятно, участвующих в процессах образования фиброза и развития воспаления в легких (miR-22, miR-150 и miR-106b). После проведения расширенного исследования, включающего наблюдение за развитием заболевания в динамике, данный набор может быть использован в клинической практике для определения активности заболевания и развития процессов формирования фиброза в тканях легкого у пациентов с различными вариантами течения гиперчувствительного пневмонита.

В ответ на повреждающие факторы высвобождается каскад цитокинов, запускающих процессы воспаления, фиброгенеза. Цель исследования – изучить уровень цитокинов – IL-6, IL-10, IL-18, TNFα в плазме крови в условиях табачной интоксикации и при внутримышечном введении аминофталгидразида. В опыте использовано 40 беспородных белых крыс-самцов. Интактная группа (n = 10) – находились в затравочной камере без табачного дыма. Опытные группы (1, 2, 3) – n = 30, по 10 животных в каждой группе. Первая и вторая группы животных находились в условиях табачного дыма один и два месяца. Третьей опытной группе внутримышечно вводили аминодигидрофталазиндион натрия в течение 3, 7, 14 дней. Содержание IL-6, IL-10, IL-18, TNFα в плазме крови определяли методом иммуноферментного анализа. В 1-й группе уровень TNFα в плазме крови повысился до 452,14±176,18 пг/мл (у интактных – 15,23±3,13 пг/мл), во 2-й группе снизился показатель до 9,8, в 3-й группе – цифры резко увеличились до 167,44±5,93 пг/мл. Уровень IL-6 был самым высоким после 4-месячной табачной интоксикации (3-я группа). Цитокин IL-10: в 1-й группе цифры увеличились в 1,2 раза, во 2-й отмечалось резкое снижение показателя в 13,7 раза, в 3-й группе – уменьшение содержания цитокина в плазме крови в 28,8 раза по сравнению с интактными животными. После введения аминодигидрофталазиндиона натрия в течение 3 и 7 дней содержание TNFα резко увеличилось в 14,8 раза и в 7,6 раза; через 14 дней применения препарата уровень TNFα уменьшился в 1,3 раза по сравнению с интактными животными. Отмечены колебания показателей провоспалительных цитокинов – IL-6 и IL-18. Уровень IL-10 в плазме крови имел статистически значимое повышение показателя в 5,3 раза через 3 дня после введения препарата; в 8,2 раза через 7 дней после применения аминодигидрофталазиндиона натрия и в 23 раза после 14 дней эксперимента (сравнение показателей с 3-й группой). В условиях табачной интоксикации изменяется концентрация TNFα, IL-6, IL-10, IL-18. Иммунный ответ обусловлен повышением уровня провоспалительных цитокинов в плазме крови. В условиях коррекции аминодигидрофталазиндионом натрия происходит увеличение противовоспалительного цитокина – IL-10 при системном снижении содержания TNFα, IL-6, IL-18.

Аллогенная трансплантация гемопоэтических клеток входит в стандарт лечения пациентов с острым лейкозом высокого риска. Пуповинная кровь (ПК) является альтернативным источником аллогенных стволовых гемопоэтических клеток для пациентов, которые нуждаются в трансплантации, но не имеют родственного донора. Цель исследования: изучение особенностей лейкоцитарного пула (клеточного состава, иммунофенотипа) концентрата клеток пуповинной крови (ПК), которые заготавливаются для публичного долгосрочного криохранения для нужд трансплантологии. Проведено исследование 1096 образцов пуповинной крови доношенных новорожденных до и после процессинга (выделения концентрата гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Показано, что при использовании критерия обработки образцов ПК с количеством лейкоцитов не менее 15 × 10⁸ лейкоцитов в пересчете на объем заготовленного образца ПК до обработки с антикоагулянтом среднее количество клеток в концентрате ГСК ПК объемом 25 мл, находящегося на долгосрочном криохранении составляет: лейкоцитов – 17,41±0,36 × 10⁸, ГСК с иммунофенотипом (CD34⁺) – 5,25±3,6 × 10⁶, натуральных киллерных клеток (CD3-CD16⁺CD56⁺) – 1,65±0,7 × 10⁸. Изучена субпопуляционная структура NKлимфоцитов в концентрате ГСК ПК: иммунофенотип CD56^dimCD16^dim клеток встречался в большинстве случаев – 45,15±18,1%, а минорные субпопуляции CD56^dimCD16^bright, CD56^-CD16⁺, CD56^brightCD16 составили 0,27±0,2, 1,33±0,7 и 0,99±0,4% соответственно. При анализе популяции NKT-клеток было выявлено 6,22±2,1% клеток с иммунофенотипом СD3⁺CD16/СD56⁺, количество CD3⁺CD56⁺ клеток составило 3,69±2,4%, количество CD3⁺CD16⁺ – 2,53±1,2%. В пуле NKT-клеток выявлены 5,15±2,1% CD56⁺CD16^- клеток, также определены две минорные субпопуляции, которые отличаются по экспрессии антигенов CD56 и CD16: уровень CD56^-CD16⁺ составил 2,91±1,2%, а CD56⁺CD16⁺ оказалось равным 0,69±0,3%. Полученные данные о количестве и характеристике иммунофенотипа клеток, также гетерогенности популяции NK- и NKT-лимфоцитов в концентрате ГСК ПК, заложенных на долгосрочное криохранение, необходимо учитывать для подбора концентрата ГСК ПК с целью трансплантации при онкогематологических заболевания.

Тимэктомия в ряде клинических ситуаций является вынужденным этапом кардиохирургического лечения врожденных пороков сердца, но вопрос о ее влиянии на формирование иммунитета в раннем онтогенезе остается открытым. До сих пор среди ученых ведутся споры о развитии иммунодефицитных состояний у детей, перенесших тимэктомию в раннем возрасте. Как в зарубежной, так и отечественной литературе можно видеть совершенно разнополярные мнения. Одним из направлений в решении этого вопроса может быть морфофункциональное исследование удаленного тимуса с помощью современных методов сканирующей электронной микроскопии. Цель исследования – изучить возможности сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах для морфологической и функциональной оценки тимуса, вынужденно удаленного у детей первых недель жизни с врожденными пороками сердца. Было проведено исследование тимуса новорожденного ребенка (27-й день постнатальной жизни) с врожденным пороком сердца: дефект межжелудочковой перегородки при помощи визуализации методом сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах после заливки в эпоксидную смолу. Масса тимуса составила 15,7 грамма, размеры тимуса: поперечный – 3,4 см, продольный – 4,1 см, толщина – 1,7 см; объем – 12,4 см3. Проведенное исследование показало возможности сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах в морфологической и в функциональной оценке тимуса как центрального органа иммунной системы. Поэтапная визуализация от малых к большим увеличениям, от тканей к клеткам и внутриклеточным структурам, а также послойное исследование коркового, мозгового вещества, междольковых перегородок и сосудов, позволяет эффективно оценить функциональность тимуса. Данный метод исследования является достаточным для научных исследований вынужденно удаленного тимуса, так как дает возможность для визуализации его микроанатомии. Позволяет проводить фенотипирования клеток различных слоев тимуса, изучать межклеточные взаимодействия тимоцитов с ретикуло-эпителиальными клетками, тонкие особенности телец Гассаля и, наконец, процесс покидания тимуса Т-лимфоцитами.